经纬行研 | “涨姿势”：PROTAC如何成长为治疗新秀？
蛋白降解靶向嵌合体（ProteolysisTargeting Chimeras, PROTAC）是一种双功能结构的药物分子，通过诱导泛素-蛋白酶体系统（UPS）来降解与疾病相关的靶蛋白。PROTAC分子一般由三部分组成：靶蛋白结合配体、linker以及E3连接酶配体。作用原理是：通过PROTAC分子，将E3连接酶与靶蛋白靠近并将其标记泛素分子，触发蛋白酶体从而降解靶蛋白，达到治疗疾病的目的。
来源：Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (2019)
PROTAC的技术源头可追溯到泛素（Ubiquitin, Ub）调节的蛋白降解过程，也叫泛素-蛋白酶体系统（UPS），UPS和自噬/溶酶体途径是细胞内蛋白降解和维持稳态的主要途径。泛素是一种76个氨基酸残基的小蛋白质，在所有真核生物中高度保守。蛋白质泛素化是一种ATP依赖的酶促反应，包括泛素激活酶（E1酶）、泛素结合酶（E2酶）和泛素连接酶（E3酶）三个主要成分。首先，泛素分子被E1酶以ATP依赖的方式激活。然后，激活的泛素被转移到E2酶，最后，E3连接酶催化泛素分子从E2转移至靶蛋白的赖氨酸残基进而与之形成共价键。经过泛素标记的蛋白被26s蛋白酶体识别并被水解成多肽片段。由于发现了泛素-蛋白酶体系统，Aaron Ciechanover, Avram Hershko和Irwin Rose三人于2004年被授予了诺贝尔化学奖。
针对该降解系统，Raymond. Deshaies和Craig. Crews等人在2001年最早提出了PROTAC的概念，并成功地设计和合成了第一批PROTAC双功能分子用于降解甲硫氨酰氨肽酶2（MetAP-2），后者更是创立了第一家以PROTAC技术进行药物开发的公司——Arvinas，其开发治疗前列腺癌的药物ARV-110以及治疗乳腺癌的药物ARV-471均进入临床I期，这也是该领域内唯一进入临床阶段的PROTAC药物。
PROTAC技术发展至今已有20年历史，但其在成药方面一直颇受挑战，最早只能作为实验技术应用于蛋白质的降解，这是因为初代的PROTAC分子E3连接酶的配体都是短肽，因此分子透膜性较差，细胞活性较低，通常在微摩尔级别。随着E3连接酶的不断发现以及小分子配体的出现，PROTAC才真正进入成药阶段，降解活性也达到了皮摩尔级别，截止目前，已有近40种癌症相关靶蛋白可以用PROTAC技术进行高效降解，其各自开发时间梯度如下图所示：
来源：Cell Biochemistry& Function (2018)
PROTAC的发展离不开E3连接酶配体的发现，目前常用PROTAC设计的E3连接酶有：VHL类、CRBN类、MDM2类、cIAP1类等。
（1）VHL类
Von Hippel Lindau（VHL）是一种抑癌基因，可通过调控HIF-1α的降解来介导肿瘤的发生发展，因此早期PROTAC设计便以HIF-1α上的八肽作为配体，后期随着VHL结构的解析，HIF-1α被含有羟脯氨酸的小分子药物取代。Ciulli实验室在2015年公布筛选到的最优化合物与VHL具有几十纳摩尔级别的亲和力，再使用已公布的靶蛋白抑制剂作为PROTAC分子另一部分，可成功降解雌激素相关受体α(ERRα)、RIPK2等，并且在体内肿瘤异种移植模型中的降解率也达到了40%。目前已报道的利用VHL型E3连接酶进行PROTAC降解的靶蛋白有BCR-ABL、BRD4、TBK1、几种跨膜酪氨酸激酶（EGFR、HER2和C-MET）和TRIM24蛋白等。
（2）CRBN类
2010年，Cereblon（CRBN）蛋白被发现是著名药物“反应停”沙利度胺的靶点，后者可激活CRBN与损伤DNA结合蛋白1（damaged DNA bindingprotein 1, DDB1）、Cullin-4A（CUL4A）、cullins 1调控子（Roc1）结合，形成E3泛素连接酶复合物。基于此原理，研究者利用度胺类药物骨架结构邻苯二甲酰亚胺进行PROTAC分子设计成功靶向降解BRD2/3/4、FKBP12、BCR-ABL、BRD9、Sirt2、CDK9、FLT3、BTK、ALK、CDK4/CDK6和HDAC6等蛋白。2015年，Craig Crews课题组使用泊马度胺作为CRBN招募配体，利用OTX015（BRD4抑制剂）进行设计的PROTAC分子对BRD4的降解效果（IC50）达到皮摩尔级别，远低于OTX150与泊马度胺单独使用效果，这说明作用于BRD4的PROTAC分子可以参与蛋白质降解的多个循环。
（3）MDM2类
MDM2是经典抑癌基因p53的抑制蛋白，通过直接作用在p53的活性位点；或者作为E3连接酶介导p53的泛素化降解过程。MDM2作为E3连接酶的特性在2008年被应用于PROTAC，Crews等人利用Roche的MDM2抑制剂Nutlins3设计PROTAC来降解雄激素受体（AR），这也是史上第一个基于小分子的PROTAC。后续优化过程中，以idasanutlin作为新的MDM2招募配体设计的PROTAC分子对靶蛋白BRD4的降解率达到98%，并且可以促进p53和p21蛋白水平的大幅提升，从而展现出很好的协同抗肿瘤活力。
（4）cIAP1类
基于cIAP1类PROTAC由Hashimoto课题组开发，他们将将甲基苯丁抑制素类似物（MeBS，methylbestatin）与全反式维甲酸连接起来，靶向降解CRABP-1/2，其中MeBS可选择性地结合到cIAP1的BIR3结构域，而全反式维甲酸是CRABP-1/2蛋白的抑制剂。
由于MeBS选择性不高，常伴有严重副反应，且其可以诱导cIAP1自身发生泛素化而降解，因此很大限制了此类配体的使用。如将MeBS换成其他配体可以避免这一现象发生。对MeBS做进一步的结构优化，发现其酰胺衍生物可以保留与cIAP1的结合活性，且不会引起cIAP1的自身泛素化降解。目前该系统可以成功靶向降解ERα，Bcl-Abl，BRD4和磷酸二酯酶-4（PDE4）。
传统药物研发领域最热门的两个方向是蛋白激酶抑制剂和单克隆抗体，这两种药物发挥作用都需持续占据靶蛋白的活性位点以阻断功能，属于“占位驱动 (occupancy driven)”，这也是经典受体药理学的一个标志。药物设计时通常需要满足：足够大的剂量（使靶点饱和）；足够长的半衰期（持续抑制靶蛋白）；足够高的亲和力（与配体/受体竞争），但因此也产生很多问题，比如说剂量大，毒副作用也高；亲和力太高，容易造成on-off-target效应；结合位点产生突变或者靶蛋白过表达，出现耐药。
PROTAC与靶蛋白接触时，只需提供结合活性，触发靶蛋白与E3酶结合从而引发降解这一事件，属于“事件驱动(event driven)”，不需要直接抑制目标蛋白的功能活性，药物不需要与目标蛋白长时间和高强度的结合，因此PROTAC理论上具有如下优势：用量小，催化剂量即可，药物安全窗口大；克服因靶蛋白突变/过表达引起的耐药；不依赖亲和力，选择性高；清除蛋白堆积。
更为重要的是，PROTAC可以靶向传统难以成药的蛋白。据研究，在已被解析的疾病相关蛋白中，有高达80%的蛋白无法用现有药物去靶向，主要是由于大多蛋白-蛋白相互作用（PPI）没有深腔和明确的结合位点，只有平坦的蛋白质界面，无论是大分子抗体或小分子抑制剂都难以发挥作用。PROTAC分子只需要短暂与靶蛋白表面结合，即可诱导靶蛋白泛素化及降解，该过程不受传统均衡占有率的限制，更类似于一种催化行为，研究表明，PROTAC可在纳摩尔（nM）浓度下将蛋白质水平降低90%以上，这对于利用占有驱动的模型是不可能实现的。
来源：Drug Discovery Today:Technologies (2019)
虽然PROTAC有着以上种种优势，但其发展道路并不顺畅，自2001年Craig Crews提出PROTAC概念以来，至今还没有药物能够上市，最快的也才刚刚进入I期临床，主要问题在于成药性。
PROTAC的分子量一般都在700以上，打破了传统小分子药物化学的lipinski五定律：即分子量小于500；氢键供体数目小于5；氢键受体数目小于10；脂水分配系数小于5；可旋转键的数量不超过10个。该原则是小分子细胞通透性的一个重要指标，后经修改，去掉了氢键受体数目和可旋转键数量的限制。对于三联体的PROTAC而言，无论从分子量上还是复杂性上都违背了小分子成药原则，因此在成药性上不可避免存在许多挑战，如水溶性、口服生物利用度、代谢稳定性、透膜性、合成难度和成本、PK/PD等等。
在水溶性以及生物利用度方面，MDM2以及VHL的配体亲脂性都较高，因此口服吸收具有很大的挑战，CRBN类配体由于具有独特的属性，并且分子量较低，因此用来设计PROTAC分子在口服吸收方面更有优势，目前也是PROTAC设计的主流方向。目前所应用的几种E3连接酶都是广泛表达于体细胞中，但随着研究人员发现具有组织特异性表达水平的某类E3连接酶后，需要从药理学/毒理学角度以及ADME的考虑因素来理解不同组织间E3的相对表达。
在代谢稳定性方面，PROTAC由于具有三元结构，E3连接酶配体、靶蛋白配体以及linker的种类和长度均会影响三元结构的稳定性，并且会产生更多的代谢产物，给安全/毒性评价带来很大的考验。除此之外，代谢产物也会影响PROTAC分子与靶蛋白、E3连接酶形成三元复合物的稳定性，降低靶蛋白降解的效率，这一点在高浓度的PROTAC下也会观察到，通常叫作“钩子”效应。
除了ADME之外，脱靶毒性也是大家重点关注的一个问题。目前PROTAC连接靶蛋白的一端几乎都是已公布结构的配体或相应小分子抑制剂，因此具有较高的选择性，但PROTAC是事件驱动型催化反应，其对于正常组织上表达靶蛋白的影响，目前还需要密切观察。
自从Arvinas公司（由PROTAC先驱——耶鲁大学Craig Crews教授创办）宣布其两款PROTAC产品获批IND之后，PROTAC技术已经越来越受到科研界和资本市场的认可，众多药企纷纷布局该领域。2019年10月份，Arvinas公布了其两款PROTAC产品的I期临床部分数据：ARV-110（靶向降解AR）与ARV-471（靶向降解ER）在各自剂量组内均耐受良好，无剂量限制性毒性，未观察到2级上不良反应，且ARV-110的140mg与ARV-471的30mg达到了平均血浆暴露量和平均最大浓度，并且该浓度已经高于肿瘤抑制剂量的下限。
Arvinas于2018年10月IPO上市，除了股权融资之外，依靠PROTAC，公司还跟大药企积极展开合作以扩充资金链，如Genentech、Pfizer、Bayer等，这也是众多大药企进入PROTAC领域的主要方向。
除此之外，还有C4 Therapeutics、Kymera、Cedilla、Nurix、Vividion Therapeutics以及Cullgen等企业也在积极推进PROTAC研发，目前都处于临床前阶段，预计2020年将会有部分管线获批IND开启临床。
国内也有部分企业开始布局PROTAC技术，如成都分迪科技、上海和径药业、海创药业、凌科药业等，但相应化合物还都处于临床前研究或更早期，相信随着更多临床数据的公布，这一领域内会有更多企业进入。
PROTAC技术虽然已经进入临床，但还需要进一步的研究来确定PROTAC在体内的效果，随着ADME优化的进一步发展，PROTAC在成药性方面的挑战逐渐会被克服，届时其作为一种新疗法，将最终为患者带来福音。
来源 | 海松健康投资 周峰
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参考文献：
(1) The PROTAC technology in drug development. Cell Biochemistry& Function (2018)
(2) Targeted protein degradation: elements of PROTACdesign. Current Opinion in Chemical Biology (2019)
(3) Proteolysis targeting chimeras (PROTACs) in ‘beyond rule-of-five’ chemicalspace: Recent progress and future challenges. Bioorganic & MedicinalChemistry Letters (2019)
(4) PROTACs– a game-changing technology. Expert Opinionon Drug Discovery (2019)
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图文编辑 | 李浩、彭庶文
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